內容概述：

2022年3月，輝駿生物的合作伙伴——中山大學中山眼科中心團隊在期刊Advanced Science（IF₂₀₂₀=16.806）上發(fā)表題為“MYPT1/PP1-Mediated EZH2 Dephosphorylation at S21 Promotes Epithelial-Mesenchymal Transition in Fibrosis through Control of Multiple Families of Genes “的文章。實驗發(fā)現甲基轉移酶EZH2在晶狀體中高表達，AKT-EZH22通路在TGF-β誘導的上皮-間質轉化（EMT）中非常重要。質譜分析結果顯示，MYPT1/PP1能使EZH2-S21去磷酸化。這些結果確定了EZH2-S21的特異性磷酸酶，并揭示了EZH22去磷酸化控制的、與晶狀體EMT和眼睛前囊下白內障（ASC）發(fā)病相關的幾個基因家族。

主要技術：

shRNA慢病毒穩(wěn)轉株構建、免疫共沉淀（Co-IP）、蛋白質譜檢測（LC-MS/MS）、CRISPR/Cas9；

輝駿生物為本研究提供了蛋白質譜檢測和分析服務（LC-MS/MS）。

研究背景：

EZH2是多梳抑制復合物2(PRC2)中發(fā)揮甲基轉移酶活性的核心成員，可以催化H3K27Me3，進而抑制下游基因轉錄。此外，EZH2還可以作為獨立于PRC2復合物的非組蛋白甲基轉移酶，甲基化轉錄因子和其他靶標。蛋白磷酸化在EZH2功能開關中起著重要作用。已知AKT激酶可以介導EZH2-S21磷酸化來抑制其H3K27Me3催化功能。然而，負責EZH2-S21去磷酸化的酶仍然未知。

研究路線：

研究結果：

1. EZH2在晶狀體上皮細胞中高表達且其活性和S21磷酸化水平隨EMT而增強

為了解EZH2在晶狀體中的作用，Western blot（WB）檢測了3周齡和成年小鼠晶狀體上皮細胞和纖維細胞中的EZH2和EZH2-S21磷酸化（p-EZH2 S21）水平，結果顯示：EZH2在3周齡和成年上皮細胞中均高表達，p-EZH2 S21在成年上皮細胞中的水平顯著高于3周齡小鼠，EZH2和p-EZH2 S21在成年纖維細胞中幾乎檢測不到（圖1A，B）。

正因為EZH2在小鼠晶狀體中高表達，因此推測其可能參與ASC上皮細胞的EMT進程。對患者和小鼠模型的ASC斑塊進行IF和WB分析，發(fā)現AKT活性和p-EZH2 S21水平顯著高于對照（圖1C-E）。低活性的EZH2（表現為較高的p-EZH2-S21和較低的H3K27me3）伴隨著為高水平的EMT標記物（FN和α-SMA）（圖1E）。

圖1

2. TGF-β激活AKT-EZH2-H3K27Me3通路來介導晶狀體上皮細胞中的EMT

為了確定AKT是否也能磷酸化EZH2-S21來調節(jié)晶狀體細胞的EMT，作者首先用TGF-β處理人晶狀體上皮細胞系HLE 48小時，建立了EMT模型，接著用AKT活性抑制劑來封閉AKT的活性，這使得p-EZH2 S21減弱，H3K27Me3增強，并且消除了TGF-β誘導引起的EMT標記物FN1和α-SMA的水平增加；AKT1和AKT2的敲低也得到了類似結果（圖2A-G）。這表明AKT能調控EZH2-S21磷酸化，介導TGF-β誘導的晶狀體上皮細胞EMT。

圖2

3. MYPT1-PP1使EZH2-S21去磷酸化

那么是哪個蛋白酶去磷酸化EZH2-S21呢？作者利用OA（PP1和PP2A的有效抑制劑）處理HLE細胞，發(fā)現OA劑量依賴性的增加了p-EZH2 S21水平（圖3A-B）。免疫共沉淀質譜（Co-IP MS）分析發(fā)現EZH2的結合蛋白除了有PRC2的其他組分SUZ12、EED和RBBP4之外，還有PP1調節(jié)亞基PPP1R12A（也稱為MYPT1），這引起了作者的注意。Co-IP WB和IF實驗進一步確定了EZH2和MYPT1間的相互作用（圖3C-F）。

圖3

4. MYPT1敲除增強了晶狀體上皮細胞EMT

為了證實MYPT1-PP1通過去磷酸化EZH2影響晶狀體上皮細胞的EMT進程，作者采用CRISPR/Cas9技術敲除HLE細胞中的MYPT2，發(fā)現p-EZH2 S21增強，H3K27Me3水平下降（圖4A-C），并且TGF-β誘導的EMT顯著增強（圖4D-G）。MYPT2和EZH2沉默的斑馬魚突變體也表現出嚴重的心臟水腫、脊柱彎曲和小眼等表型，眼部組織中的EMT標志物（FN1a, LAMC2和MMP9）也顯著上調。這些結果表明，MYPT1-PP1可以使EZH2去磷酸化，激活其甲基轉移酶活性，并在體外和體內調節(jié)EMT。

圖4

5. 內源性EZH2-S21突變抑制了TGF-β誘導的EMT

為了進一步確定EZH2-S21磷酸化能否從功能上控制EMT進程，作者采用EZH2野生型和EZH2-S21突變型（絲氨酸突變成賴氨酸）慢病毒分別感染HLE細胞構建穩(wěn)轉細胞株（圖5A-C），WB和IF分析證實，相比于空載對照，它們的表達均顯著抑制了TGF-β誘導的EMT標志物上調（圖5D-G）。

圖5

6. EZH2去磷酸化調控多個EMT相關的基因家族

為了找到EZH2去磷酸化調控的下游基因，作者對EZH2野生型、EZH2-S21突變型和空載對照細胞株進行了轉錄組分析, GO分析結果顯示很多差異基因屬于細胞外基質基因和細胞粘附基因；之后又在敲除了內源EZH2的細胞中再表達EZH2野生和EZH2-S21突變體，并用TGF-β處理。qPCR檢測了轉錄組篩選出的差異基因，確定了三個參與EMT調控的基因家族——膠原基因、細胞外基質基因和細胞粘附基因（圖6A-D）。為了進一步證實EZH2去磷酸化調控了這3個基因家族，選取了3個主要靶基因Col1A1、MMP17和POSTN進行ChIP-seq，發(fā)現TGF-β處理的HLE細胞中的H3K27me3水平遠小于未處理組（圖6E）。

圖6

7. EZH2-S21磷酸化調控POSTN基因來促進TGF-β誘導的EMT和ASC

為了進一步確定上述EMT相關基因家族確實受EZH2-S21去磷酸化控制并參與EMT和AGS病變，研究者利用慢病毒構建EZH2沉默的HLE細胞系，再此基礎上分別進行EZH2過表達、EZH2-S21A過表達和EZS2-S21D過表達（圖7A-C）。qPCR檢測發(fā)現POSTN在EZS2-S21D細胞中的豐度最高（圖7D）。使用CRISPR/Cas9技術（圖7E）或shRNA（圖7F）敲除MYPT1可顯著增加POSTN mRNA水平，在MYPT1突變的斑馬魚眼睛中也觀察到POSTN的表達增強。

在POSTN沉默細胞中，TGF-β處理組的EMT標記物（FN、COL1A1、SNAI1和SNAI2）水平均顯著低于非沉默細胞（圖7G-J）。在POSTN基因敲除小鼠中，ASC的誘導受到限制，EMT標志物（FN、COL1A1）的表達也顯著降低（圖7K-M）。在患者ASC斑塊中，POSTN也高表達（圖7N）。

圖7

8. MYPT敲除促進了EMT相關基因表達和AGS病變

為了進一步確定EZH2-S21去磷酸化直接控制的EMT相關基因，研究者用TGF-β處理MYPT敲除細胞或未敲除細胞，qPCR方法檢測發(fā)現SPARC、BGN、PCDHB8、PCDHB16、COL1A1、COL4A1、COL4B2和COL7A1的水平顯著高于對照（圖8A）。在ASC小鼠模型（圖8B）和人類ASC患者（圖8C）中也得到了相似結果，表明這些由EZH2-S21去磷酸化控制的EMT相關基因顯著促進了ASC病變。

圖8

研究結論：

該研究不僅確定了AKT激活EZH2-H3K27Me3來調控TGF-β誘導的晶狀體上皮細胞EMT，而且發(fā)現了MYPT1-PP1可使EZH2-S21去磷酸化，進而調控3個EMT相關基因家族參與ASC病變（圖8D）。