SILAC-IP * 實(shí)驗(yàn)原理

用SILAC結(jié)合免疫共沉淀（CoIP）尋找相互作用蛋白是SILAC在定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究基礎(chǔ)上的進(jìn)一步應(yīng)用，稱之為SILAC-IP技術(shù)。該技術(shù)通過質(zhì)譜鑒定和分析蛋白質(zhì)相對(duì)量來判斷是否是特異性結(jié)合誘餌蛋白，當(dāng)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中某個(gè)蛋白質(zhì)量含量達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)的差異時(shí)，就判定這個(gè)蛋白質(zhì)與誘餌蛋白質(zhì)具有相互作用。SILAC技術(shù)是先將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的蛋白帶上不同的同位素，即重鏈、輕鏈氨基酸蛋白。復(fù)合物分離后，混在同一管中做酶切質(zhì)譜等。這樣既能鑒定到復(fù)合物蛋白，又能根據(jù)同位素峰強(qiáng)度判斷誘餌蛋白組和對(duì)照組中蛋白的相對(duì)含量，從而更準(zhǔn)確地判斷出互作蛋白。

SILAC-IP * 實(shí)驗(yàn)方案

不同的實(shí)驗(yàn)背景和目的需對(duì)應(yīng)用不同方案，輝駿生物提供以下三種SILAC-IP實(shí)驗(yàn)方案：

方案一：以野生型細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)材料

1．分別用輕、重鏈氨基酸培養(yǎng)細(xì)胞，取等量標(biāo)記好的細(xì)胞提取蛋白質(zhì)；
2．提取的輕鏈、重鏈細(xì)胞總蛋白分別用Normal IgG和抗bait蛋白的特異抗體做Co-IP；
3．混合輕、重鏈Co-IP產(chǎn)物；
4．胰酶酶切，LC-MS/MS鑒定和定量蛋白。

方案二：以過表達(dá)誘餌蛋白的細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)材料

1. 分別用輕、重鏈氨基酸培養(yǎng)正常對(duì)照細(xì)胞和過表達(dá)誘餌蛋白的細(xì)胞株(帶標(biāo)簽)，取等量標(biāo)記好的細(xì)胞分別提取蛋白質(zhì)，并再次定量；
2. 取等量蛋白混合，用誘餌蛋白抗體做Co-IP；
3. 收集Co-IP后的蛋白液，胰酶酶切，LC-MS/MS鑒定和定量蛋白。

方案三：以干擾誘餌蛋白的細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)材料

1. 分別用輕鏈、重鏈氨基酸培養(yǎng)RNAi 誘餌蛋白的細(xì)胞株和正常對(duì)照細(xì)胞株，取等量標(biāo)記好的細(xì)胞分別提取蛋白質(zhì)，并再次定量；
2. 取等量蛋白混合，用誘餌蛋白抗體做Co-IP；
3. 收集Co-IP后的蛋白液，胰酶酶切，LC-MS/MS鑒定和定量蛋白。

SILAC-IP * 應(yīng)用背景

免疫共沉淀（Co-IP）在分離純化蛋白復(fù)合物過程中，不可避免地會(huì)出現(xiàn)非特異結(jié)合蛋白，這些蛋白會(huì)一并被質(zhì)譜鑒定出來，成為假陽性的互作蛋白，影響后續(xù)挑選驗(yàn)證。 傳統(tǒng)的判斷假陽性互作蛋白方法是：用誘餌蛋白組鑒定到的蛋白列表，扣除掉對(duì)照組鑒定到的蛋白列表，作為“互作蛋白”。但很多真實(shí)的互作蛋白，比如豐度比較高的蛋白，在對(duì)照組中也會(huì)出現(xiàn)，而傳統(tǒng)的方法就會(huì)被排除掉。SILAC-IP技術(shù)將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的蛋白帶上不同的同位素，結(jié)合質(zhì)譜分析，既能鑒定到復(fù)合物蛋白，又能根據(jù)同位素峰強(qiáng)度判斷誘餌蛋白組和對(duì)照組中蛋白的相對(duì)含量，從而更準(zhǔn)確地判斷出互作蛋白。

相較于傳統(tǒng)的免疫共沉淀和pull down技術(shù)，SILAC-IP技術(shù)特異性強(qiáng)，假陽性極低，通量高，靈敏度高，能直接檢測出與bait蛋白互作的其他蛋白的相對(duì)含量；適合于可傳代細(xì)胞，尤其是易轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。

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18927549347

SILAC-IP * 輝駿服務(wù)內(nèi)容

SILAC-IP（SILAC標(biāo)記的免疫共沉淀）檢測服務(wù)
服務(wù)項(xiàng)目	服務(wù)內(nèi)容	結(jié)果交付	實(shí)驗(yàn)周期	客戶提供	價(jià)格
SILAC-IP	Co-IP預(yù)實(shí)驗(yàn)	input和CoIP產(chǎn)物的Western blot檢測圖	2-3周	未標(biāo)記的待測細(xì)胞 SILAC標(biāo)記完全的待測細(xì)胞 誘餌蛋白的IP級(jí)抗體 實(shí)驗(yàn)信息表（樣本信息、抗體信息、誘餌蛋白序列）	點(diǎn)擊詢價(jià)
	SILAC標(biāo)記效率檢測	標(biāo)記效率檢測表 標(biāo)記效率檢測報(bào)告	2-3周
	Western blot檢測SILAC標(biāo)記細(xì)胞（input）中的誘餌蛋白	Western blot檢測圖	7-8周
	CoIP實(shí)驗(yàn)調(diào)取誘餌蛋白及其互作蛋白	Western blot檢測圖 CoIP實(shí)驗(yàn)報(bào)告
	IP產(chǎn)物的SILAC蛋白定量檢測和分析	質(zhì)譜檢索表 互作蛋白篩選表 互作蛋白生物信息學(xué)分析結(jié)果 SILAC檢測和分析報(bào)告

SILAC-IP * 結(jié)果示例

silac ip：質(zhì)譜檢索表格（部分展示）

SILAC-IP  * 客戶文獻(xiàn)

1. Chen Y.J. et al: Identification of Novel SCIRR69-Interacting Proteins During ER Stress Using SILAC-Immunoprecipitation Quantitative Proteomics Approach. Neuromolecular Med. 2017，IF=2.629. 【研究內(nèi)容】：為了更好地研究CREB/ATF家族成員SCIRR69在ER應(yīng)激過程中的功能作用，研究者首先用ER應(yīng)激激活劑(TG)和衣霉素(TM)處理了SCN和PC12細(xì)胞,，qRT-PCR和western結(jié)果顯示SCIRR69可能在ER應(yīng)激中起重要作用。采用SILAC IP方法篩選出ER過程中SCIRR69的相互作用蛋白TERA和SFXN1，并通過Co-IP技術(shù)驗(yàn)證了它們與SCIRR69的相互作用。研究結(jié)果有助于更好地理解SCIRR69在ER應(yīng)激中的基本功能。 使用相關(guān)技術(shù)：silac ip檢測、silac ip服務(wù)、SILAC IP免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)服務(wù)

2. Edward. E. et al Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics. Journal of Visualized Experiments.  2014，IF=1.163. 【研究內(nèi)容】：每個(gè)骨髓瘤患者都有多個(gè)亞克隆，具有高或低染色體不穩(wěn)定性(CIN)特征的多個(gè)亞克隆共存會(huì)導(dǎo)致異質(zhì)性和耐藥性，導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)。作者通過串聯(lián)親和純化質(zhì)譜(TAP-MS)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了CIN基因NEK2與脫泛素酶USP7結(jié)合。該結(jié)合阻止了NEK2泛素化并使其穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn)，使用NEK2或USP7抑制劑進(jìn)行靶向治療可能是骨髓瘤最有效的輔助治療方法。 使用相關(guān)技術(shù)：silac ip技術(shù)、silac ip免疫共沉淀、SILAC-IP質(zhì)譜

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? 廣泛靶向代謝組學(xué)

蛋白/核酸相互作用實(shí)驗(yàn)

? GST pull down

? RNA pull down

? DNA pull down

? Co-IP 免疫共沉淀

? TAP-MS串聯(lián)親和純化

分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

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? 載體構(gòu)建實(shí)驗(yàn)服務(wù)

?miRNA靶基因驗(yàn)證
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? 重組抗體表達(dá)

實(shí)驗(yàn)試劑盒

? RNA pull down 試劑盒

? GST pull down 試劑盒

? COIP 試劑盒

? Flag 試劑盒

輝駿實(shí)力

4899+客戶已添加微信獲取實(shí)驗(yàn)優(yōu)惠！

SILAC-IP（SILAC標(biāo)記的免疫共沉淀）服務(wù)介紹

SILAC-IP是在SILAC標(biāo)記細(xì)胞中進(jìn)行Co-IP（免疫共沉淀）的技術(shù)。

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SILAC IP實(shí)驗(yàn)服務(wù)*輝駿優(yōu)勢

SILAC標(biāo)記的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)樣本要求

1. 送樣要求

2. 樣本保存和運(yùn)輸要求：

（1）活細(xì)胞常溫取樣；

（2）凍存細(xì)胞干冰取樣/運(yùn)輸：需要至少在送樣前一天通知我方。

silac-ip技術(shù)服務(wù)結(jié)果示例

silac ip：質(zhì)譜檢索表格（部分展示）

免疫共沉淀SILAC-IP 客戶文獻(xiàn)

1. Chen Y.J. et al: Identification of Novel SCIRR69-Interacting Proteins During ER Stress Using SILAC-Immunoprecipitation Quantitative Proteomics Approach. Neuromolecular Med. 2017，IF=2.629. 【研究內(nèi)容】：為了更好地研究CREB/ATF家族成員SCIRR69在ER應(yīng)激過程中的功能作用，研究者首先用ER應(yīng)激激活劑(TG)和衣霉素(TM)處理了SCN和PC12細(xì)胞,，qRT-PCR和western結(jié)果顯示SCIRR69可能在ER應(yīng)激中起重要作用。采用SILAC IP方法篩選出ER過程中SCIRR69的相互作用蛋白TERA和SFXN1，并通過Co-IP技術(shù)驗(yàn)證了它們與SCIRR69的相互作用。研究結(jié)果有助于更好地理解SCIRR69在ER應(yīng)激中的基本功能。 使用相關(guān)技術(shù)：silac ip檢測、silac ip服務(wù)、SILAC IP免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)服務(wù)

2. Edward. E. et al Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics. Journal of Visualized Experiments.  2014，IF=1.163. 【研究內(nèi)容】：每個(gè)骨髓瘤患者都有多個(gè)亞克隆，具有高或低染色體不穩(wěn)定性(CIN)特征的多個(gè)亞克隆共存會(huì)導(dǎo)致異質(zhì)性和耐藥性，導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)。作者通過串聯(lián)親和純化質(zhì)譜(TAP-MS)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了CIN基因NEK2與脫泛素酶USP7結(jié)合。該結(jié)合阻止了NEK2泛素化并使其穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn)，使用NEK2或USP7抑制劑進(jìn)行靶向治療可能是骨髓瘤最有效的輔助治療方法。 使用相關(guān)技術(shù)：silac ip技術(shù)、silac ip免疫共沉淀、SILAC-IP質(zhì)譜

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